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四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室陈俐娟研究员团队:Pironetin共价结合于α-微管蛋白的316位半胱氨酸并导致微管去稳定


四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室陈俐娟研究员团队2016年6月发表于Nature Communications的文章"Pironetin reacts covalently with cysteine-316 of a-tubulin to destabilize microtubule"(影响因子:12.353)(长按下方二维码即可阅读原文)。




微管(Microtubule)是抗肿瘤药物研发的重要靶点。微管是“细胞骨架”的主要成分之一,在许多细胞重要事件中起着关键作用。微管是由α-和β-微管蛋白(Tubulin)异二聚体可逆地组装而成的线性管装结构(图 1a)


图1 微管和微管蛋白的结构。(a)微管蛋白二聚体从头到尾排列形成微管,其构象由弯曲变直,二聚体之间同时纵向和横向接触。(b-e)微管与已知 5 个位点之间的相互结合图:(b)长春碱和秋水仙碱结合于 β-tubulin 的具体位点;(c)微管聚合剂Laulimalide 在 β-tubulin 上的结合位点;(d)微管抑制剂美登木素在 β-tubulin 上的结合位点;(e)微管聚合剂在 β-tubulin 上的结合位点。蛋白由 cartoon 形式表示,小分子用球形模式表示


天然产物长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇、laulimalide 和美登素都与 β-微管蛋白结合并干扰其正常动力学过程从而抑制微管蛋白的聚合或解聚:长春碱、秋水仙碱和美登素抑制微管蛋白异二聚体聚合形成微管,而紫杉醇和 laulimalide 促进聚合和稳定微管。结构生物学详细描述了这五种天然化合物如何结合并改变 β-微管蛋白的构象从而改变微管和微管之间的动力学特征(如图 1b-e)。 这些工作使得新一代理性设计微管抑制剂成为可能,极大地有助于微管药物的开发。紫杉醇代表了最成功的一类在临床使用的抗肿瘤药物,目前其全球销售额已经超过300亿美元。但是,在病人进行治疗时, βIII-微管蛋白的表达会增加,这种微管蛋白与紫杉醇的结合很弱,这种突变的微管蛋白能够抵抗紫杉醇的治疗从而产生耐药性。


Pironetin是一个天然小分子,是目前报道的唯一与α-微管蛋白相互作用的小分子。其展示了良好的体内外抗肿瘤活性,同时在多药耐药细胞上同样有效。日本的研究人员通过详尽的实验方法证明Pironetin结合于α-微管蛋白的352位赖氨酸。在他们的研究中明确说明了Pironetin不会与半胱氨酸结合。但不幸的是,基于 K352 的Pironetin结合模型给Pironetin衍生物的设计带来了困难,多数研究都显示,改造以后Pironetin活性明显下降。因此,鉴于 Pironetin衍生物的修饰合成没有取得进展, Piroentin 衍生物的设计就此被搁置了。但是,开发靶向 α-微管蛋白的药物仍然具有巨大开发价值。这种新型的靶向α-微管蛋白的药物很可能不受 β-微管蛋白的突变及 βIII-微管蛋白的高表达所影响,从而其在耐药细胞上也会有效。四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室陈俐娟课题组一直从事抗微管药物研发,为了推进靶向 α-tubulin 抑制剂的开发,该课题组对Pironetin与微管蛋白的相互作用进行深入的研究,获得了与之前的研究完全不同的结果。通过结构生物学及质谱实验结果显示,Pironetin 确实是结合在α-微管蛋白上,但是其共价结合的位点为 316 位半胱氨酸,而不是 352 位赖氨酸(图2)。



图2 微管蛋白-RB3-TTL-Pironetin复合物的结构。(a)Pironetin-微管蛋白-RB3-TTL的结构。(b)Pironetin在α-微管蛋白单体的口袋中的近视图。 (c)Pironetin结合口袋表面的横截面图


同时通过生物质谱实验更进一步证实了Pironetin结合于α-微管蛋白的316位半胱氨酸。如图3所示,该肽段的二级质谱碎片显示Pironetin结合于 Cys316。



图3 α-微管蛋白的Pironetin共价修饰的肽段的MS / MS二级碎裂质谱图


在总体水平上,Pironetin与α2-微管蛋白亚基的结合导致了 α1β1 异二聚体相对于α2β2异二聚体之间约2°的旋转(图4a)。在二级结构层面造成了明显的T7 loop环的偏移(残基Phe244至Leu259的变化):Val250的Cα原子移动超过11Å,而 Leu252和Gly246已经分别偏移了6Å和8Å(图 4b)。为了适应 Pironetin的结合,Cys316两侧的残链S8不同侧链都有小的位移(图4c)。Glu254在空白结构中是关键的催化残基,Glu254与水分子结合,水分子又与邻近的 β1-微管蛋白的 Mg2+离子结合(图4c),而 Mg2+ 离子又与 GDP 的磷酸盐接触,从而调控GTP水解。Pironetin导致的Glu254位置的偏移所造成的β-微管蛋白的GTPase活性降低(图 4c-d)可能是另外的Pironetin抑制微管聚合的机制。至此作者详细地解释了Pironetin与α-微管蛋白的相互作用,为后续开发靶向α-微管蛋白的药物奠定了基础。



图4 Pironetin结合导致微管结构的变化。(a)apo形式和与Pironetin结合的复合物中的微管蛋白结构的比较。(b)apo蛋白形式(蓝色)和复合物形式蛋白中(绿色)H8的主要主链变化。(c)α-微管蛋白的催化残基E254与衔接头结合上的F255一起重新定向。(d)Pironetin抑制微管蛋白的GTPase活性,与长春碱类似,与秋水仙碱相反


专家点评


程伟教授:微管是抗肿瘤药物研发的热点,临床上市的药物如紫杉醇,长春碱及艾日布林等均靶向β-微管蛋白,但β-微管蛋白容易突变而导致耐药性的产生。相对而言,α-微管蛋白不易突变,是一个更好的抗肿瘤靶蛋白。因此开发靶向 α-微管蛋白的抗肿瘤药物具有重要的研究价值。但目前为止仅有一个天然小分子Pironetin被报道共价结合于 α-微管蛋白。但是其结合位点等相关机制仍然不清楚。陈俐娟研究员课题组长期致力于抗肿瘤微管蛋白抑制剂的研究,成功解析了Pironetin-微管蛋白复合物的晶体结构,发现了Pironetin的结合位点为α-微管蛋白的316位半胱氨酸,成功解释了Pironetin的作用机制。他们报道了一个全新的靶向α-微管蛋白的小分子结合位点,对于后续开发靶向α-微管蛋白的新型微管抑制剂具有重要意义。



程伟,博士,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室教授。主要针对重大疾病(如癌症、感染性疾病)进行药物靶标发现、验证及结构和功能研究,主要利用X-ray和cryo-EM技术,结合生物化学、遗传学及细胞生物学从事蛋白质机器研究。以通讯作者或第一作者(包括共同) 在ScienceNature子刊、Cell子刊等国际高影响力期刊发表论文数篇。程教授目前主持四川大学、四川大学华西医院及国家自然科学基金委员会等项目;荣获2014美国“Judith Graham Pool Postdoctoral Research ”奖项;并入选国家“千人计划”青年项目,四川省“千人计划”领军人才项目。


作者投稿心得


该文章从最开始发现到最后文章见刊发表仅用了一年半时间,是与各领域的专家合作才能达到如此高的效率。在通讯作者陈俐娟研究员的统筹指导下:共同第一作者杨建洪、王太津负责药理及计算机辅助设计等实验;王誉熹、蒋健负责结构生物学实验;共同通讯作者朱晓峰负责晶体结构解析,同时邀请了英国皇家科学院院士James H. Naismith参与文章的撰写指导。该文章的快速发表充分体现了合作及协同创新在科研中的重要作用。


作者


博士后杨建洪、王誉熹,博士生王太津及硕士生蒋健为共同第一作者,四川大学华西医院陈俐娟研究员与四川大学生命科学院朱晓峰教授为通讯作者


通信作者



陈俐娟,博士,四川大学二级教授,博士生导师,博士后合作导师,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室副主任,教育部新世纪优秀人才获得者,2017年度“药明康德生命化学研究奖”获得者。现任中华中医联盟协会会员,中国医药生物技术协会纳米生物专业委员会理事;《四川大学学报医学版》编委;中国西部有机质谱委员会副理事长;四川省生物技术协会副理事长;四川省靶向抗癌学会副理事长。长期从事天然药物小分子和靶向小分子的药物开发研究,作为项目/课题负责人主持完成20余项国家及省部级科研项目,包括国家863重大项目1项,重大新药创制5项,国家自然科学基金仪器重大专项1项,自然科学基金联合基金重点项目1项,面上项目5项。在Nature CommunicationJournal of Medicinal ChemistryBiomaterialJournal of Controlled Release等期刊以通讯作者身份发表 SCI 收录论文200余篇,申请美、英、德、中等国家发明专利50余项,其中授权专利25项。经过多年积累,其研究团队成果成功实施转化,目前有多个候选化合物已进入临床前评价,1个国家天然产物一类创新药物已进入I期临床,1个国家一类创新药物申报临床研究。


通信作者



朱晓峰,四川大学生命科学学院教授2006年6月获英国斯特拉思克莱德大学和格拉斯哥大学联合授予的生物科学博士学位。博士毕业至2012年9月在英国圣安德鲁斯大学从事研究工作6年,参与了多项由英国生物技术研究委员会(BBSRC)资助的酶学和结构生物学研究重大项目。2011年入选四川省首批“百人计划”青年项目(现四川省“千人计划”),2012年10月回四川大学生命科学学院工作,主要以天然产物生物合成途径中具有特殊催化功能的酶为研究对象,开展酶晶体结构和催化反应机理的研究,以通讯作者或第一作者发表文章在Nat CommunJACSJBCJMB等学术期刊上。


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本文编辑:张 敏

本文排版:陈红梅 张洪雪


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